La storia riprende da dove si era concluso Assassin's Creed II: Ezio Auditore fugge dal Vaticano con lo zio Mario, subito dopo aver sconfitto Rodrigo Borgia ed essere entrato nella cripta, dove Minerva attraverso di lui invia un messaggio a Desmond Miles, esortandolo a trovare tutti i Templi con i Frutti dell'Eden prima del 21 dicembre 2012.
Tuttavia, il giorno dopo il ritorno di Ezio a Monteriggioni, le truppe papali guidate da Cesare Borgia assediano la città. Monteriggioni, assieme a Villa Auditore, viene danneggiata e Mario viene ucciso per mano di Cesare. Ezio, ferito da tre colpi di archibugio, fugge assieme alla popolazione da una galleria sotto al Santuario. In cerca di vendetta, Ezio torna a Roma per sconfiggere i Borgia una volta per tutte.
Nel frattempo Shaun, Rebecca, Lucy e Desmond giungono nell'odierna Monteriggioni, tentando di entrare nel Santuario di Villa Auditore, ma non riescono ad entrare perché il passaggio è bloccato. Una volta entrati grazie alla galleria che Ezio usò per fuggire, Desmond rientra nell'Animus e torna ad accedere ai ricordi del suo antenato italiano.
Ciò che Ezio trova a Roma va al di là di ogni sua aspettativa. La città eterna è avvolta dal degrado per via della politica egoista e spietata dei Borgia, che soffoca e rovina tutta la città. Ad Ezio, quindi, spetterà il compito di liberare tutte le zone di Roma oppresse dai Borgia, distruggendo le torri tramite cui la famiglia del Papa controlla la città, contribuendo così alla rinascita delle botteghe e il restauro di monumenti importanti come il Colosseo o il Pantheon.
Dopo esser venuto a sapere di Caterina Sforza, catturata da Cesare, dalle gilde alleate (secondo cui Caterina sarebbe a Castel Sant'Angelo), Ezio decide di infiltrarsi nel castello con l'obiettivo di uccidere sia Rodrigo che Cesare. Tuttavia, Cesare ha già lasciato il castello per la conquista di Urbino, mentre Rodrigo non è presente. Ezio riesce a salvare però Caterina e a rinchiudere Lucrezia Borgia, (sorella di Cesare, con cui ha una relazione) nella cella della Sforza.
Mentre fa ritorno al covo, Ezio incontra Leonardo da Vinci, costretto a lavorare per Cesare, che gli progetta nuove armi in cambio del suo aiuto nel distruggere le macchine belliche progettate da lui per i Borgia. Questo incarico lo porterà a compiere missioni sui Colli Albani, a Napoli, nella Valnerina, e sul Monte Circeo. Ezio decide di sfaldare l'influenza dei Borgia su Roma. Tornato al Covo, Ezio, assieme al suo Gran Maestro Niccolò Machiavelli, decide di ricostruire la Confraternita degli Assassini a Roma. Reclutati degli adepti, Ezio scova il suo primo bersaglio: Juan Borgia il Maggiore, banchiere di Cesare, che viene ucciso durante una manifestazione dove sono presenti sia Rodrigo che suo figlio. Dopo Juan, ora è il turno del barone francese Octavian de Valois, nemico di Bartolomeo ed alleato militare di Cesare. Octavian riesce a rapire la moglie di Bartolomeo, Pantasilea Baglioni, e nel tentativo riuscito di salvarla, Octavian viene ucciso da Ezio. In seguito, viene informato che Pietro Rossi, un attore che Lucrezia Borgia utilizza come pedina per ingelosire Cesare, ha con sé la chiave per entrare a Castel Sant'Angelo, ed Ezio vuole recuperarla, ma Cesare intende uccidere Pietro mandando il suo sicario Micheletto. Pietro è impegnato in una recita della Passione nel Colosseo, e Micheletto decide di avvelenare il vino che durante la recita l'uomo assaggia. Ezio si infiltra tra gli attori assieme ai suoi adepti, vestendosi da centurioni, e riesce a salvare l'attore portandolo da un medico, e decide di risparmiare Micheletto.
Dopo aver preso da Pietro la chiave del castello, Ezio, sotto consiglio di Machiavelli, si reca ad uccidere definitivamente Cesare e Rodrigo Borgia; quest'ultimo viene però ucciso dallo stesso Cesare che lo soffoca mettendogli una mela avvelenata in bocca, la stessa arma che Rodrigo voleva usare per togliere di mezzo il figlio. Ezio fa così intrusione nella dimora, dove apprende da Lucrezia Borgia, ormai sotto shock, l'ubicazione del Frutto dell'Eden (il Cortile del Belvedere) e, dopo averla presa, la usa per neutralizzare le ultime forze di Cesare Borgia. Dopo un'ultima battaglia tra gli Assassini e gli ultimi soldati fedeli a Cesare, quest'ultimo viene arrestato da Fabio Orsini con le accuse di omicidio e di incesto. Ezio, consultando la Mela, va a Viana, dove ha la meglio su Cesare e lo getta dalla muraglia, lasciando che sia il fato a decretare la sua sorte. Tornato a Roma, nasconde la Mela dell'Eden all'interno di un Tempio sotto Santa Maria in Aracoeli, accessibile da una galleria segreta sotto al Colosseo: il Tempio di Giunone. Ha poi continuato il suo incarico come Gran Maestro dell'Ordine degli Assassini a Roma.
Desmond e gli altri assassini conoscono finalmente il nascondiglio della Mela dell'Eden, e partono per Roma. Il primo, quindi, entra nella galleria sotto al Colosseo, uscendone fuori a Santa Maria in Aracoeli, dove si ricongiunge con i compagni. Attivato una specie di ascensore nascosto nel pavimento, la squadra entra nel Tempio di Giunone, dove trovano la Mela. Tuttavia, appena Desmond la tocca, la dea Giunone prende il controllo del suo corpo. Desmond non riesce a reagire ed è costretto a pugnalare con la lama celata Lucy, che cade a terra in un bagno di sangue, probabilmente morta. Partono i titoli di coda, durante i quali si sentono le voci di due uomini che decidono di mettere Desmond sotto shock dentro l'Animus, nonostante la riluttanza del primo. Attraverso il DLC La Scomparsa di Da Vinci, si può notare che, a un certo punto, uno dei due uomini in questione chiamerà l'altro William, l'uomo a cui scrive Lucy, nelle sue e-mail.
Ricordi di Cristina
Durante e dopo la fine del gioco è possibile incontrare Cristina Vespucci se la sincronizzazione totale è abbastanza alta. La figura di Cristina è stata importante nella vita di Ezio, e tramite questi ricordi è possibile capire cosa sia successo fra i due, dato che nel secondo capitolo la ragazza compare brevemente solo all'inizio.
Una seconda occasione
Il ricordo è ambientato pochi mesi prima dell'inizio delle vicende del secondo capitolo. Il giovane Ezio incontra Cristina nel 1476 e su consiglio del fratello Federico tenta un approccio ma viene liquidato dopo un sorriso della ragazza. Ezio non si da per vinto e decide di riprovarci, e la segue fin sotto casa senza farsi vedere dalla fanciulla. Sotto il portone di casa ad aspettare Cristina c'è Vieri De Pazzi, che le salta addosso, stanco dei rifiuti della ragazza. Ezio interviene e per salvare la ragazza picchia Vieri, che poco prima di fuggire giura vendetta su Ezio e sulla sua famiglia. Cristina ringrazia Ezio dandogli un bacio sulla guancia e ciò crea le basi per una relazione tra i due.
Estrema unzione
Questo ricordo è ambientato subito dopo l'esecuzione degli Auditore. Ezio incontra Cristina che lo accompagna nella ricerca dei cadaveri dei suoi fratelli e del padre. Ezio picchia una guardia per sapere dove sono le salme dei suoi cari e dopo averlo scoperto si reca nei pressi del fiume Arno. Intenzionato ad uccidere le guardie che sono vicino alle salme (che hanno il compito di gettare nel fiume i cadaveri), cambia idea dopo che Cristina lo supplica di non prendere le loro vite. Ezio recupera le salme e le posa su una barca, potendo finalmente eseguire il rito funebre. Ezio chiede a Cristina di partire con lui, ma Cristina rifiuta perché non vuole lasciare la sua famiglia. Prima di partire per Monteriggioni, Ezio le dona un ciondolo che simboleggia la loro unione e la bacia prima di andare via.
Testimone dello sposo
Durante il 1478, Ezio torna a Firenze e scopre da Cristina che ormai la ragazza è promessa in moglie a Manfredo Soderini. La ragazza sceglie questo pretendente perché credeva che Ezio non sarebbe più tornato nella sua città natale. Durante il colloquio tra i due un uomo e una donna dicono a Cristina che Manfredo è assalito da alcuni uomini a cui doveva dei soldi. Ezio salva il fidanzato di Cristina. Dopo aver ucciso i giocatori d'azzardo, Ezio afferra Manfredo e su un ponte sospeso sul fiume gli chiede se lui ama veramente Cristina e Manfredo risponde di sì. Ezio gli ordina di smettere di giocare d'azzardo e di essere un marito ideale per Cristina, altrimenti gli avrebbe dato la caccia. In seguito, Ezio torna da Cristina e la bacia, dicendole che ha fatto in modo che Manfredo sia un buon marito per lei. La ragazza, delusa, accetta la decisione di Ezio.
Persona non gradita
Durante il Carnevale di Venezia, nel 1486, Leonardo da Vinci dice a Ezio che Cristina è in città per il Carnevale. Preoccupato che Cristina non voglia vederlo dopo tutti quegli anni, Ezio le dà una lettera, presentandosi come il marito e chiedendo di incontrarlo da sola in un vicolo. Cristina lo bacia credendolo suo marito Manfredo, ma appena gli toglie la maschera, la ragazza si arrabbia e gli dice che lo amava e che non poteva tornare dopo otto anni, e che non deve più cercarla perché ormai è sposata.
Pene d'amore perdute
Nel 1498, Ezio torna ancora una volta a Firenze e tra le strade fiorentine vi trova Manfredo morente, dopo un attacco dei seguaci di Savonarola. Poco prima di morire dice a Ezio che la Vespucci è in pericolo. Ciò allarma Ezio che subito la ritrova uccidendo i suoi inseguitori. Tuttavia Cristina è già ferita a morte e sofferente tra le braccia di Ezio gli mostra il ciondolo che aveva conservato durante gli ultimi 22 anni, e gli dice che avrebbe voluto che entrambi avessero avuto una seconda possibilità. Ezio capisce che ormai non può più far niente per salvare la sua amata e l'accompagna durante il suo viaggio sussurrandole "Riposa in pace, amore mio".
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) Quest'anno è Certa una Sola Citta: Roma, (non si sa ancora niente sulle altre). 
