La storia di Assassin's Creed inizia nel settembre del 2012, quando un barista di nome Desmond Miles (il personaggio controllato dal giocatore), si risveglia dopo una sessione difettosa dell'Animus (un macchinario in grado di visionare le memorie dell'antenato di chi lo usa) all'interno dei laboratori delle Industrie Abstergo dopo essere stato rapito. Desmond è stato "scelto" per il progetto per via del suo antenato Altaïr, un membro della setta degli Assassini vissuto durante la Terza Crociata in Terra Santa; i dirigenti dell'Abstergo mostrano particolare interesse su qualcosa con cui è venuto a che fare Altaïr e vorrebbero saperne di più. Ma la mente di Desmond inizialmente rigetta le memorie di Altaïr (الطائر in arabo), dovendo quindi iniziare da un ricordo precedente in modo che la mente di Desmond si abitui e gradualmente e gli conceda di visionare il ricordo che gli interessa. I due ricercatori che lavorano al progetto Animus e supervisioneranno il lavoro di Desmond sono il dottor Warren Vidic e la sua assistente Lucy Stillman questi gli spiegano che nel DNA sono contenuti non solo le informazioni genetiche ma anche i ricordi degli antenati (questo sarebbe alla base dell'istinto animale) l'Animus è in grado di prendere queste informazioni e di proiettarle come immagini.
Altaïr durante un assassinio
Il primo ricordo risale ad un importante missione di recupero del tesoro dei templari nel Tempio di Salomone durante la quale tenta di uccidere il gran maestro dei Templari Roberto di Sable, tuttavia fallisce, viene separato dai compagni a causa di una frana ed è costretto a ritornare a mani vuote a Masyaf, uno dei suoi compagni Malik riuscirà a recuperare l'artefatto, perdendo però un braccio e il fratello, poiché Altaïr, troppo fiducioso in se stesso, ha messo in pericolo tutta la setta. Roberto di Sable, deciso a riprendersi ciò che gli è stato tolto decide di assediare Masyaf con i suoi uomini, grazie ad un aiuto interno si fa aprire le porte ma i suoi uomini vengono uccisi sotto le mura del castello per una trappola azionata da Altair ed è costretto a ritirarsi. Per aver trasgredito a tutti i principi della setta Al Mualim, maestro della setta, lo processa e lo accoltella. Una volta curato Altaïr viene degradato da Priore (il secondo grado più alto) al grado di Novizio (il più basso rango nell'ordine degli Assassini), Al Mualim però gli offre la possibilità di redimersi assassinando nove uomini, responsabili di fomentare la guerra in corso nella regione, così facendo riporterà la pace nella regione e riacquisterà il proprio grado di Priore.
Ma nel corso della sua avventura scoprirà che tutti i suoi bersagli (uomini sia appartenenti alla fazione dei Crociati che a quella dei Saraceni) sono collegati tra di loro da un patto di sangue, simile a quello degli Assassini: il loro obiettivo è creare un nuovo mondo, e per ottenerlo gli serve l'artefatto rubato. A ogni obiettivo eliminato, ad Altaïr viene restituito un rango e una parte del suo equipaggiamento. Procedendo nella sua missione, Al Mualim gli spiegherà che la setta rivale altri non sono che i Templari; essi vogliono avere il controllo della Terra Santa, ma non in nome della Chiesa, bensì per loro stessi, per "imporre" la pace e creare così "il mondo perfetto", e per raggiungere lo scopo si sono infiltrati in entrambi gli schieramenti (Alcuni di loro sono infatti reggenti di città, comandanti di eserciti o grandi mercanti). Al Mualim spiegherà anche che condivide la loro idea di pace, ma non i mezzi per ottenerla; infatti i bersagli di Altaïr compiono gesti atroci, come condanne a morte sommarie o esperimenti medici su esseri umani oltre i limiti della morale. Nell'assassinare Roberto di Sable a Gerusalemme, si scopre in realtà che il Templare non è mai stato in quella città, si trova invece a Arsuf, nella famosa battaglia per coalizzare Crociati e Saraceni contro gli Assassini, usando come espediente gli omicidi degli altri otto obiettivi, (fondamentali per entrambi gli eserciti), così facendo gli Assassini non avrebbero avuto alcuna possibilità di salvezza contro le forze congiunte di Crociati e Saraceni. Così Altaïr arriva in tempo ad Arsuf per dire a re Riccardo, di come Roberto intendesse tradirlo. Per mettere alla prova la fedeltà del suo luogotenente fa sfidare i due in duello decretando che Dio farà vincere il giusto. Dopo essere stato vinto e in punto di morte Roberto di Sable rivela ad Altair che erano 10 gli uomini a sapere del Tesoro di Salomone e che il decimo è Al-Mualim ma che, a differenza degli altri 9, non voleva condividere quel potere con nessuno e per dimostrargli la sua buona fede gli fa notare di come egli sapesse sempre dove trovare i bersagli. Tornato di corsa a Masyaf Altaïr scopre che l'intero villaggio è sotto il controllo mentale di Al Mualim.
Il maestro gli rivela il motivo per cui gli ha fatto assassinare i bersagli, ovvero per impedire che altri mettessero le mani sul manufatto, il "Frutto dell'Eden" in grado di controllare i cuori e le menti di chi lo contempla, anche se stranamente Altaïr sembra immune al controllo mentale. Al Mualim rivelerà anche ad Altaïr dei poteri del Frutto dell'Eden, e di come alcuni episodi biblici e storici non sono altro che illusioni generate dallo stesso artefatto. Dopo un duro scontro, Altaïr uccide Al Mualim e l'artefatto si attiva disegnando un mappamondo olografico (con una precisione impossibile per il XII secolo), rivelando la locazione di altri "Frutti dell'Eden".
Con le memorie di Altaïr complete, a Desmond è rivelato che all'Abstergo servivano i ricordi del protagonista per sapere dove cercare gli artefatti, infatti la compagnia vuole usarli per creare un mondo perfetto, essendo i Templari odierni, (notare anche che abstergo in latino vuol dire purificare, ripulire) volendo controllare le menti di tutto il globo attraverso un lancio satellitare con il "Frutto dell'Eden" a bordo, e uccidendo chiunque resisterà. L'Abstergo non ha più bisogno di Desmond e lo vorrebbe eliminare, Ma Lucy lo salva, dicendo che le sue memorie potrebbero ancora servire, e di non lasciare niente al caso. Vidic lascia la stanza dicendo a Desmond di non rilassarsi troppo e che ci sarà ancora bisogno di lui.
Nel corso della storia sarà mostrato come Lucy sia in realtà anch'essa membro degli Assassini, infiltrata nell'Abstergo per controllare Desmond e spiare i dirigenti. Proprio lei spiegherà a Desmond che l'Abstergo è stata fondata dai Templari, che hanno governato il mondo segretamente fino a quell'epoca, e che ancora danno la caccia agli Assassini. Nella conclusione del gioco Desmond vedrà attraverso l'"occhio dell'aquila", come sapeva fare il suo antenato, Lucy allontanarsi (con un alone blu) e Vidic (con un alone rosso). Poi andrà nella sua stanza per vedere il muro pieno di simboli ignoti e scritte in lingue straniere, tutto realizzato con sangue. Inoltre, curiosando nei computer presenti si potranno scoprire alcuni dettagli riguardanti la Abstergo e le sue attività.
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